Hromatografija je jedna od metoda za odvajanje supstanci. Koristi se za naknadnu kvalitativnu i kvantitativnu analizu fizičkih i hemijskih svojstava mikročestica. Varijanta ove tehnologije je afinitetna hromatografija. Ideja o diferenciranju proteinskih spojeva korištenjem svojstva molekularnog afiniteta poznata je u nauci već nekoliko decenija. Međutim, svoj razvoj je dobio tek posljednjih godina, nakon uvođenja visokoporoznih hidrofilnih materijala koji se koriste kao matrica. Ova metoda omogućava rješavanje analitičkih problema (odvajanje supstanci i njihova identifikacija) i preparativnih problema (prečišćavanje, koncentracija).
Essence
Afinitetna hromatografija (od latinske reči affinis - "susedan", "povezan") zasniva se na afinitetnim interakcijama, koje predstavljaju formiranje visoko specifičnih veza između molekula razmaka (liganda ili afiniteta) i ciljnog molekula. Ovi mehanizmi su široko rasprostranjeni u prirodi (povezivanje medijatora ili hormona i receptora, antitijela iantigeni, hibridizacija polinukleotida i drugi tipovi procesa). U medicini, afinitetna hromatografija se koristi u praktične svrhe od 1951. godine
Komponente su razdvojene na sljedeći način:
- radni rastvor koji sadrži supstancu koju treba izolovati propušta se kroz sorbent;
- ligand deponovan na matricu sorbenta zadržava ovu supstancu;
- je koncentriran (akumulacija);
- ekstrakcija izolovane supstance iz sorbenta ispiranjem sa rastvaračem.
Ova metoda vam omogućava da izolujete cijele ćelije. Razlika od tradicionalne sorpcijske hromatografije je u tome što postoji snažno biospecifično vezivanje izolovane komponente za sorbent, koju karakteriše visoka selektivnost.
Adsorbenti
Sljedeće supstance se koriste kao adsorbenti:
- Gel jedinjenja na bazi agaroze, polisaharida dobijenog iz agara. Najčešće se koriste 3 varijante: sefaroza 4B, CL (umrežena agaroza) i afi-gel. Potonji sastav je modificirani gel agaroze i poliakrilamida. Ima veću biološku inertnost, visoku hemijsku i termičku otpornost.
- Silika (silika gel).
- Glass.
- Organski polimeri.
Da bi se eliminisale mehaničke prepreke tokom kontakta liganda, koriste se dodatne supstance da ga odvoje od nosača (peptidi, diamini, poliamini, oligosaharidi).
Oprema
Oprema za afinitetnu hromatografiju uključuje sljedeće glavne jedinice:
- rezervoari za mobilnu fazu (eluent);
- pumpe visokog pritiska za srednje snabdevanje (najčešće klipne);
- filter za čišćenje eluenata od prašine;
- uređaj za doziranje;
- kromatografska kolona za odvajanje smjese;
- detektor za detekciju odvojenih komponenti koje napuštaju kolonu;
- hromatogramski snimači i mikroprocesorska jedinica (računar).
Da bi se smanjila količina rastvorenog vazduha, helijum se prvo propušta kroz mobilnu fazu. Za promjenu koncentracije eluenta, instalirano je nekoliko pumpi koje kontrolira programator. Kromatografske kolone su izrađene od nehrđajućeg čelika (za povećane zahtjeve za otpornost na koroziju), stakla (univerzalna opcija) ili akrila. Za preparativne svrhe, njihov prečnik može varirati od 2 do 70 cm. U analitičkoj hromatografiji koriste se mikrokolone Ø10-150 µm.
Da bi se povećala osetljivost detektora, u smešu se unose reagensi koji doprinose stvaranju supstanci koje apsorbuju više zraka u ultraljubičastom ili vidljivom delu spektra.
Metodologija
Postoje 2 glavne vrste tečne afinitetne hromatografije:
- Kolona, u kojoj se kolona puni stacionarnom fazom i kroz nju se protokom propušta smjesaeluent. Odvajanje se može dogoditi pod pritiskom ili pod gravitacijom.
- Tan sloj. Eluent se kreće duž ravnog sloja adsorbenta pod uticajem kapilarnih sila. Adsorbent se nanosi na staklenu ploču, keramičku ili kvarcnu šipku, metalnu foliju.
Glavne faze rada uključuju:
- priprema adsorbenta, fiksacija liganda na nosač;
- ubacivanje smjese za odvajanje u hromatografsku kolonu;
- mobilno fazno punjenje, vezivanje komponenti ligandom;
- zamjena faze za izolaciju vezane supstance.
Odredište
Afinitetna kromatografija se koristi za izolaciju sljedećih tipova supstanci (tip korištenog liganda je naznačen u zagradama):
- analozi enzimskih inhibitora, supstrata i kofaktora (enzima);
- bioorganske supstance sa znacima genetske stranosti, virusi i ćelije (antitijela);
- ugljikohidrati visoke molekularne težine, monosaharidni polimeri, glikoproteini (lektini);
- nuklearni proteini, nukleotidiltransferaze (nukleinske kiseline);
- receptori, transportni proteini (vitamini, hormoni);
- proteini u interakciji sa ćelijskim membranama (ćelijama).
Ova tehnologija se takođe koristi za dobijanje imobilizovanih enzima, a njihovo vezivanje za celulozu omogućava proizvodnju imunosorbenata.
Hromatografija proteina koji vežu DNK
Izolacija DNK-vezujućih proteina se vrši pomoćuheparin. Ovaj glikozaminoglikan je sposoban da veže širok spektar molekula. Afinitetna hromatografija proteina ove grupe koristi se za izolovanje supstanci kao što su:
- faktori inicijacije i elongacije translacije (sinteza molekula nukleinske kiseline i proteina);
- restriktaze (enzimi koji prepoznaju određene sekvence u dvolančanoj DNK);
- DNK ligaze i polimeraze (enzimi koji kataliziraju spajanje dvaju molekula kako bi se formirala nova hemijska veza i uključeni su u replikaciju DNK);
- inhibitori serin proteaze koji igraju važnu ulogu u imunološkim i upalnim procesima;
- faktori rasta: fibroblast, Schwann, endotel;
- proteini ekstracelularnog matriksa;
- hormonski receptori;
- lipoproteini.
Dostojanstvo
Ova metoda je jedna od najspecifičnijih za izolaciju reaktivnih spojeva (enzima i većih agregata - virusa). Međutim, ne koristi se samo za izolaciju biološki aktivnih supstanci.
Detekcija antitijela u malim količinama, kvantitativna procjena poliadenilne kiseline, brzo određivanje molekularne mase dehidrogenaza, uklanjanje određenih zagađivača, proučavanje kinetike aktivacije neaktivnog oblika tripsina, molekularna struktura čovjeka interferoni - ovo nije cela lista studija u kojima se koristi afinitet.hromatografija. Upotreba u klinici je zbog njenih prednosti kao što su:
- Efektivno čišćenjeproteini, polisaharidi, nukleinske kiseline. Oni se neznatno razlikuju po svojim fizičkim i hemijskim svojstvima i gube aktivnost tokom hidrolize, denaturacije i drugih vrsta tretmana koji se koriste u drugim metodama.
- Brzina odvajanja supstanci, dinamička priroda procesa.
- Nema potrebe za posebnim pročišćavanjem enzima i homogenizacijom izoenzima za određivanje konstanti disocijacije.
- Mogu da odvoji širok spektar supstanci.
- Mala potrošnja liganada.
- Mogućnost odvajanja supstanci u velikim količinama.
- Reverzibilni proces vezivanja bioloških makromolekula.
Ova tehnika se može kombinovati sa drugim, kako bi se nametnulo dodatno polje (gravitaciono, elektromagnetno). Ovo vam omogućava da proširite tehničke mogućnosti hromatografije.
Enzimatski inženjering
Zahvaljujući ovoj metodi, započeo je aktivan razvoj nove grane biotehnologije - enzimskog inženjeringa.
Afinitetna hromatografija za izolaciju enzima ima sljedeće prednosti:
- dobivanje enzima u velikim količinama kao rezultat kraćeg vremena, kao rezultat - njihovo smanjenje cijene;
- imobilizacija enzima može značajno proširiti obim njihove primjene u medicini i industriji;
- Udruživanje enzima sa nerastvorljivom čvrstom podlogom omogućava proučavanje uticaja mikrookruženja i pravca reakcija, koje igraju važnu ulogu u prirodnim i fiziološkim procesima.
