Protočna citometrija je citološka metoda istraživanja koja se koristi za dubinsku analizu ćelija. Njegova prednost je što vam omogućava da proučavate svaku ćeliju pojedinačno. Ova vrsta analize pomaže da se procijene nekoliko parametara u stotinama ćelija u nekoliko sekundi. Kao rezultat toga, citofluorimetrija se smatra jednom od najbržih i najpreciznijih metoda analize koje su trenutno dostupne naučnicima i kliničarima.
Princip
Princip protočne citometrije zasniva se na mjerenju raspršenja svjetlosti i luminescencije (fluorescencije) ćelija. Suspenzija ćelija se propušta kao mlaz velikom brzinom kroz ćeliju citometra, gdje se ozrači laserom. Tu se izvodi i takozvano hidrodinamičko fokusiranje. Njegov mehanizam je da tok iz ćelije sa proučavanim česticama na izlazu teče u spoljašnji mlaz koji ima veću brzinu. Kao rezultat toga, čestice su poređane u uređenom lancu.
Pre-ćelije su označene posebnim fluorescentnim bojama (fluorohromima). Zahvaljujući njima, laserski snoppobuđuje sekundarni sjaj. Primljene svjetlosne signale registruju detektori. Nakon toga, informacije se obrađuju korišćenjem softverskih algoritama koji vam omogućavaju da prebrojite pojedinačne populacije ćelija koje se razlikuju po nekim kriterijumima.
Istraživanje konvencionalnom mikroskopijom često ne uspijeva razlikovati različite ćelije jer izgledaju isto. Citofluorimetrija može pružiti druge podatke (integritet DNK strukture), analizirati ekspresiju proteina, preživljavanje ćelija.
Pošto su za pobudu fluorohroma potrebni svetlosni snopovi različitih talasnih dužina, kao i različite vrste detektora, moderne instalacije su opremljene sa nekoliko kanala za detekciju (od 4 do 30). Broj laserskih emitera može biti od 1 do 7. Složeniji uređaji omogućavaju višeparametarske studije nekoliko svojstava čestica odjednom.
Prednosti i nedostaci
Prednosti protočne citometrije uključuju:
- visoka brzina obrade (registracija do 30 hiljada događaja u 1 sekundi);
- mogućnost proučavanja velikog broja ćelija (do 100 miliona u uzorku);
- Kvantitativno određivanje intenziteta fluorescentnog svjetla;
- analiza svake ćelije;
- simultano proučavanje heterogenih procesa;
- automatsko razdvajanje podataka prema populaciji ćelija;
- kvalitetna vizualizacija rezultata.
Još jedna karakteristika ove tehnologije je toanalizirana čestica se može obojiti sa nekoliko fluorescentnih rastvora. Zahvaljujući tome, dolazi do višeparametarske studije.
Nedostaci uključuju složenost tehničke opreme i potrebu za posebnom pripremom uzoraka.
Cytometers
Prvi uređaji ovog tipa pojavili su se već 1968. godine u Njemačkoj, ali su postali rasprostranjeni mnogo kasnije. Trenutno se svi uređaji koji rade metodom protočne citometrije mogu podijeliti u 2 tipa:
- uređaji koji mjere fluorescentno zračenje (dvije ili više talasnih dužina), 10° i 90° raspršivanje svjetlosti (detektor niskog ugla i bočnog raspršenja);
- uređaji koji se, pored merenja nekoliko ćelijskih parametara, automatski sortiraju u grupe prema ovim kriterijumima.
Detektor raspršivanja prema naprijed dizajniran je da odredi veličinu ćelije, a uređaj za bočno raspršivanje omogućava vam da dobijete informacije o prisutnosti intracelularnih granula, omjeru volumena citoplazme i jezgra.
Klasični citometri, za razliku od svetlosnih mikroskopa, ne dozvoljavaju dobijanje slike ćelije. Međutim, posljednjih godina razvijeni su kombinirani uređaji koji mogu kombinirati mogućnosti mikroskopa i citofluorimetra. O njima će se raspravljati u nastavku.
Slikovni citometri
Za instrumente koji se koriste u klasičnoj protočnoj citometriji,karakteristična je jedna karakteristika: ako se u populaciji analiziranih ćelija registruju rijetki događaji, onda se ne može procijeniti šta je njihova suština. Ove čestice mogu biti ili ostaci mrtvih ćelija ili njihova rijetka grupa. U konvencionalnim uređajima, takvi podaci su isključeni iz opšteg toka događaja, ali upravo oni mogu biti od posebne vrednosti za naučnu i kliničku analizu.
Nova generacija protočnih citometara za snimanje omogućava vam da snimite sliku svake ćelije koja prolazi kroz zonu detektora. Lako je to vidjeti klikom na odgovarajuću oblast dijagrama, koja se prikazuje na monitoru računara.
Područja primjene
Protočna citometrija je univerzalna metoda koja se koristi u mnogim poljima medicine i nauke:
- imunologija;
- onkologija;
- transplantologija (transplantacija crvene koštane srži, matičnih ćelija);
- hematologija;
- toksikologija;
- biohemija (mjerenje kiselosti unutar ćelije, proučavanje drugih parametara);
- farmakologija (stvaranje novih lijekova);
- mikrobiologija;
- parazitologija i virologija;
- oceanologija (proučavanje fitoplanktona za procjenu stanja vodenih tijela i drugi zadaci);
- nanotehnologija i analiza mikročestica.
Imunologija
Ljudski imuni sistem sastoji se od velikog broja ćelija. Protočna citometrija u imunologiji omogućava procjenu njihove strukture i funkcije, odnosno provođenje morfofunkcionalnihanaliza.
Ovakva istraživanja pomažu u razumijevanju složene prirode imuniteta. Fenotipovi stanica se mijenjaju kao rezultat aktivacije antigenima, razvoja patologija i drugih faktora. Citofluorometrija može odvojiti subpopulacije imunih ćelija u složenu mešavinu i proceniti sve njihove promene tokom vremena.
Onkologija
Jedan od najvažnijih zadataka u onkologiji je diferencijacija ćelija prema njihovom tipu. Princip analize protočnom citometrijom u onkohematologiji zasniva se na sljedećem fenomenu: kada se uzorak tretira posebnom fluorescentnom bojom, on se vezuje za citoplazmatske proteine. Nakon diobe u stanicama koje se aktivno razmnožavaju, njegov sadržaj se smanjuje za polovicu. Shodno tome, intenzitet ćelijske luminiscencije se dvostruko smanjuje.
Postoje i drugi načini za otkrivanje proliferirajućih ćelija:
- upotreba boja koje vežu DNK (propidijum jodid);
- upotreba označenog uracila;
- registracija povećanog nivoa ekspresije ciklinskih proteina, koji su uključeni u regulaciju ćelijskog ciklusa.
