Proučavanje bakterija je od velike praktične važnosti za ljude. Do danas je otkriven veliki broj prokariota koji se međusobno razlikuju po patogenosti, području distribucije, obliku, veličini, broju flagela i drugim parametrima. Za detaljno proučavanje ovog soja koristi se bakteriološka metoda istraživanja.
Koje su metode za analizu bakterijskih ćelija?
Da bi se utvrdilo da li su bakterije patogene, kultura se ispituje na različite načine. Među njima:
1. Bakterioskopska metoda.
2. Bakteriološka metoda.
3. Biološka metoda.
Bakterioskopske i bakteriološke metode istraživanja baziraju se direktno na radu sa prokariotskim ćelijama, kada je potrebna biološka analiza za proučavanje uticaja takvih ćelija na živi organizam eksperimentalnih životinja. Prema stepenu ispoljavanja određenih znakova bolesti, naučnik može da napravizaključak o prisutnosti ili odsustvu patogenih bakterija u uzorku, kao i njihovo prirodno razmnožavanje u tijelu životinje radi dobijanja njihove kulture i upotrebe u drugim radovima.
Bakteriološka metoda istraživanja razlikuje se od bakterioskopske. U prvom se za analizu koristi posebno pripremljena kultura živih prokariota, dok se u drugom radi sa mrtvim ili živim ćelijama na stakalcu.
Etape bakteriološke metode istraživanja. Mikrobiologija
Princip proučavanja svojstava bakterijske kulture može biti koristan kako za mikrobiologe koji su za cilj postavili proučavanje prokariotskih ćelija, tako i za laboratorijske tehničare čiji je zadatak da utvrde patogenost ili nepatogenost bakterija, i zatim dijagnosticirajte pacijenta.
Metoda proučavanja bakterija podijeljena je u tri faze:
1. Izolacija bakterija iz originalnog uzorka.
2. Sijanje bakterija i uzgoj čiste kulture, proučavanje njenih svojstava.
3. Detaljno proučavanje bakterijskih ćelija.
Prva faza
Uzorak ili razmaz se uzima sa slobodne površine podloge ili od pacijenta. Tako dobijamo "koktel" mnogih vrsta bakterija koje se moraju posijati na hranljivi medij. Ponekad je moguće odmah izolovati potrebne bakterije, znajući njihova žarišta distribucije u tijelu.
Nakon dva ili tri dana odabiru se željene kolonije iseju se na čvrste podloge Petrijevih zdjelica uz pomoć sterilne petlje. Mnogi laboratoriji rade s epruvetama koje mogu sadržavati čvrste ili tekuće hranljive podloge. Ovako se izvodi bakteriološka metoda istraživanja u mikrobiologiji.
Druga faza
Nakon dobijanja pojedinačnih kolonija bakterija, vrši se direktna makro- i mikroanaliza. Mjere se svi parametri kolonija, utvrđuje se boja i oblik svake od njih. Nije neuobičajeno brojati kolonije na Petrijevoj zdjelici, a zatim u početnom materijalu. Ovo je važno u analizi patogenih bakterija, čiji broj zavisi od stepena bolesti.
Bakteriološka metoda istraživanja, čija je 2. faza proučavanje pojedinačnih kolonija mikroorganizama, može se povezati sa biološkom metodom za analizu bakterija. Drugi cilj rada u ovoj fazi je povećanje količine izvornog materijala. To se može učiniti na hranjivom mediju, ili možete provesti eksperiment in vivo na živim eksperimentalnim organizmima. Patogene bakterije će se razmnožavati, a kao rezultat toga, krv će sadržavati milijune prokariotskih stanica. Lako je pripremiti potreban radni materijal bakterija iz uzete krvi.
Treća faza
Najvažniji dio studije je određivanje morfoloških, biohemijskih, toksigenih i antigenskih svojstava bakterijske kulture. Rad se izvodi sa prethodno očišćenim kulturama na hranljivoj podlozi, kao i sa preparatima (često obojenim) pod mikroskopom.
Postavi vlasništvopatogenih ili oportunističkih bakterija na jednu ili drugu sistematsku grupu, kao i da se utvrdi njihova otpornost na lijekove, omogućava bakteriološka metoda istraživanja. Faza 3 - antibiotici, tj. analiza ponašanja bakterijskih ćelija u uslovima sadržaja lekova u okruženju.
Proučavanje rezistencije kulture na antibiotike je od velike praktične važnosti kada je potrebno prepisati neophodne, a što je najvažnije, efikasne lijekove za određenog pacijenta. Tu može pomoći bakteriološka metoda istraživanja.
Šta je medij za rast?
Za razvoj i razmnožavanje, bakterije moraju biti u unaprijed pripremljenim hranjivim podlogama. Po konzistenciji mogu biti tečni ili čvrsti, a po poreklu - biljni ili životinjski.
Osnovni zahtjevi za medije:
1. Sterilnost.
2. Maksimalna transparentnost.
3. Optimalni pokazatelji kiselosti, osmotskog pritiska, aktivnosti vode i drugih bioloških vrijednosti.
Dobijanje izolovanih kolonija
1. Metoda Drygalskog. Sastoji se u tome da se na bakterijsku petlju nanosi bris s različitim vrstama mikroorganizama. Ova petlja se provlači duž prve Petrijeve posude sa hranljivom podlogom. Dalje, bez promjene petlje, metoda zaostalog materijala provodi se na drugoj i trećoj Petrijevoj posudi. Dakle, na posljednjim uzorcima kolonije, bakterije neće biti previše gusto zasijane, čime se pojednostavljuje mogućnost pronalaženja potrebnih za rad.bakterije.
2. Kochova metoda. Koristi epruvete sa rastopljenim hranljivim medijumom. Tamo se postavlja petlja ili pipeta s razmazom bakterija, nakon čega se sadržaj epruvete izlije na posebnu ploču. Agar (ili želatin) se stvrdne nakon nekog vremena i lako je pronaći željene ćelijske kolonije u njegovoj debljini. Važno je razrijediti mješavinu bakterija u epruvetama prije početka rada kako koncentracija mikroorganizama ne bi bila previsoka.
Bakteriološka metoda istraživanja, čije se faze zasnivaju na izolaciji željene kulture bakterija, ne može bez ove dvije metode za pronalaženje izoliranih kolonija.
Antibiogram
Vizuelno, reakcija bakterija na lijekove može se vidjeti na dva praktična načina:
1. Metoda papirnog diska.
2. Razmnožavanje bakterija i antibiotika u tečnom mediju.
Metoda papirnog diska zahtijeva kulturu mikroorganizama koji su uzgajani na čvrstom hranljivom mediju. Na takav medij staviti nekoliko komada zaobljenog papira natopljenog antibioticima. Ako se lijek uspješno nosi s neutralizacijom bakterijskih stanica, nakon takvog tretmana ostat će područje bez kolonija. Ako je reakcija na antibiotik negativna, bakterije će preživjeti.
U slučaju upotrebe tečnog hranljivog medijuma, prvo pripremite nekoliko epruveta sa kulturom bakterija različitih razblaženja. U ove epruvete se dodaju antibiotici, a tokom dana se posmatra proces interakcije između supstance i mikroorganizama. Kao rezultat, dobiva se visokokvalitetan antibiogram prema kojem je mogućeproceniti efikasnost leka za datu kulturu.
Glavni zadaci analize
Ovdje su navedeni ciljevi i faze bakteriološke metode istraživanja.
1. Nabavite početni materijal koji će se koristiti za izolaciju kolonija bakterija. To može biti bris sa površine bilo kojeg predmeta, sluzokože ili šupljine ljudskog organa, analiza krvi.
2. Uzgoj kulture na čvrstom hranljivom mediju. Nakon 24-48 sati na Petrijevoj posudi mogu se naći kolonije različitih vrsta bakterija. Odabiremo željeni prema morfološkim i/ili biohemijskim kriterijima i dalje radimo s njim.
3. Razmnožavanje rezultirajuće kulture. Metoda bakteriološkog istraživanja može se zasnivati na mehaničkoj ili biološkoj metodi povećanja broja bakterijskih kultura. U prvom slučaju, rad se izvodi s čvrstim ili tekućim hranjivim medijima, na kojima se bakterije razmnožavaju u termostatu i formiraju nove kolonije. Biološka metoda zahtijeva prirodne uvjete za povećanje broja bakterija, pa se ovdje eksperimentalna životinja inficira mikroorganizmima. Nakon nekoliko dana, mnogi prokarioti se mogu naći u uzorku krvi ili razmazu.
4. Rad sa pročišćenom kulturom. Za utvrđivanje sistematskog položaja bakterija, kao i njihove pripadnosti patogenima, potrebno je izvršiti detaljnu analizu ćelija prema morfološkim i biohemijskim karakteristikama. Prilikom proučavanja patogenih grupa mikroorganizama važno je znatikoliko su efikasni antibiotici.
Ovo je bila opšta karakteristika metode bakteriološkog istraživanja.
Karakteristike analize
Glavno pravilo bakterioloških istraživanja je maksimalna sterilnost. Ako radite sa epruvetama, kulture i subkulture bakterija treba obavljati samo preko zagrijane lampe.
Sve faze bakteriološke metode istraživanja zahtijevaju upotrebu posebne petlje ili Pasteurove pipete. Oba alata moraju biti prethodno obrađena u plamenu alkoholne lampe. Što se tiče Pasteurove pipete, ovdje je prije termičke sterilizacije potrebno pincetom odlomiti vrh pipete.
Tehnika sijanja bakterija takođe ima svoje karakteristike. Prvo, kada se inokulira na čvrstu podlogu, bakterijska petlja se provlači preko površine agara. Petlja bi, naravno, već trebala imati uzorak mikroorganizama na površini. Inokulacija u medijum kulture se takođe praktikuje, u kom slučaju omča ili pipeta treba da dođu do dna Petrijeve posude.
Pri radu sa tečnim medijima koriste se epruvete. Ovdje je važno osigurati da tekućine ne dodiruju rubove laboratorijskog staklenog posuđa ili čepova, a instrumenti koji se koriste (pipeta, omča) ne dodiruju strane predmete i površine.
Važnost metode biološkog istraživanja
Analiza uzoraka bakterija ima svoju praktičnu primjenu. Primarnobakteriološka metoda istraživanja može se koristiti u medicini. Na primjer, potrebno je proučiti mikrofloru pacijenta kako bi se postavila ispravna dijagnoza, kao i da bi se razvio ispravan tok liječenja. Tu pomaže antibiogram koji će pokazati aktivnost lijekova protiv patogena.
Analiza bakterija se koristi u laboratoriji za otkrivanje opasnih bolesti kao što su tuberkuloza, povratna groznica ili gonoreja. Takođe se koristi za proučavanje bakterijskog sastava krajnika, šupljina organa.
Bakteriološka metoda istraživanja može se koristiti za određivanje kontaminacije okoline. Prema podacima o kvantitativnom i kvalitativnom sastavu razmaza sa površine predmeta utvrđuje se stepen naseljenosti ove sredine mikroorganizmima.
