PCR, ili lančana reakcija polimerazom, je sofisticirana laboratorijska tehnika koja se široko koristi u medicini i drugim naučnim oblastima. PCR dijagnostika je u jednom trenutku postala pravi proboj u nauci.
Opis
Kvantitativni PCR je vrsta PCR-a u realnom vremenu.
Ovo se podrazumijeva kao varijanta PCR-a, u kojoj se kinetika reakcije stalno snima, što omogućava kvalitativno procjenu sadržaja specifičnih DNK nukleotidnih sekvenci u složenoj molekularnoj smjesi.
Kvantitativna PCR metoda će biti razmotrena detaljnije u nastavku.
Suština analize
Kulturološke i serološke metode posebno se često koriste za dijagnosticiranje infekcija. Pod prvim se određuju antitijela na infektivni patogen u krvnom serumu. U drugom, biološki materijal uzet od bolesne osobe koristi se za sjetvu specifične podloge koja je povoljna za rast kolonija patogena. Dijagnostika u obaslučaj može trajati danima ili sedmicama.
PCR pregled se može obaviti sa različitim biološkim materijalima koji se dobijaju od bolesne osobe. Krv i drugi patološki, fiziološki i biološki mediji i tekućine djeluju kao uzorci. Možete uraditi PCR izmet ili urin.
Atipične i virusne infekcije najčešće se dijagnosticiraju kvantitativnim PCR-om, jer ih možda nije lako dijagnosticirati zbog specifične prirode patološkog procesa koji je njima izazvan. Za utvrđivanje takvih infekcija potrebno je vrijeme tokom kojeg se u tijelu počinju proizvoditi antitijela, određena serološkim metodama. Ali to je u nekim slučajevima neprihvatljivo.
Način izvođenja
PCR metoda - laboratorijska detekcija infekcije u uzorcima izolovanim od pacijenta (in vitro).
Za izvođenje lančane reakcije polimerazom potreban je set specijalnih reagensa.
Testirani materijal se unosi u epruvete sa reagensima. Epruvete se stavljaju u poseban aparat - PCR pojačivač, koji je dizajniran za amplifikaciju (povećanje broja) željenih RNA ili DNK fragmenata, PCR pojačivač radi u cikličnom režimu. U bilo kojem ciklusu, ako uzorci sadrže RNA ili DNK sekvencu patogena, tada se sve više kopija čestica ovih nukleinskih kiselina akumulira u otopini. Možete odrediti prisustvo patogena i njegovu količinu u uzorcima.
Vrste PCR
Kvalitativna analiza pomoću PCR-a omogućava vam da dobijete sljedeći rezultat:
- negativan kada patogen od interesa nije pronađen u uzorcima;
- pozitivno ako se u uzorcima pronađu sekvence koje su karakteristične za određeni patogen.
Sa pozitivnim PCR rezultatom, možemo govoriti sa 95% tačnosti o prisutnosti dijagnostikovane infekcije. Istovremeno, tačnost PCR setova koji se koriste u dijagnostičke svrhe dostiže 100%.
Obično 5% netačnih rezultata određuje ljudski faktor. Na primjer, kršenje tehnike analize i skladištenja reagensa može značajno smanjiti tačnost studije.
Kvantitativni PCR definiše koncept virusnog opterećenja. Moguće je odrediti koliko je setova DNK patogena bilo u uzorcima uzetim od pacijenta.
Ozbiljnost infekcije direktno je proporcionalna povećanju njihovog broja. Također možete odrediti uspjeh terapije za smanjenje virusnog opterećenja.
Prijava za PCR biomaterijal
Kvantitativni PCR se izvodi u klinici, uglavnom ujutro. Prilikom posjete ljekaru pacijentu će se reći šta treba uzeti: struganje, bris, urin ili krv. PCR može otkriti patogene bez obzira na nivo kontaminacije materijala.
Za pozitivnu analizu, u teoriji, potrebno je prisustvo samo jednog patogena u uzorcima. U praksi se trude da stvore još povoljnije uslove. Postoje neke preporuke za ovo:
- ako uzmu struganje ili bris sa genitalijaorgana, morate se suzdržati od intimnih odnosa tri dana prije studije;
- ne možete se tuširati antibakterijskim lijekovima ili se umivati prije analize;
- tri sata prije uzimanja brisa iz uretre, morate biti strpljivi i ne prazniti crijeva.
Ne pridržavajte se ovih pravila prilikom davanja krvi.
Kako se tumače rezultati kvantitativne PCR analize?
Kvantitativna procjena dobijenih rezultata
U nizu kliničkih situacija javlja se problem efikasnosti liječenja i/ili dinamike patološkog procesa. Ovakva pitanja su posebno relevantna kada se ispituju osobe s kroničnim infekcijama (virus humane imunodeficijencije, hepatitis B i C). Prilikom postavljanja dijagnoze zasnivaju se na činjenici da je akumulacija amplikona (PCR proizvoda) proporcionalna prisutnosti kopija željenog gena u analiziranom uzorku.
Naravno, uzimajući u obzir rezultate kvantitativne PCR radi se gel elektroforezom uz proučavanje intenziteta posebnih PCR signala. Takođe, preduslov za ispravnu kvantitativnu procenu dobijenih rezultata su pozitivni i pouzdani kontrolni uzorci koji sadrže poznati broj kopija željenog gena (npr. hiljadu kopija gena za hepatitis C za jednu PCR reakciju). Nekoliko serijskih razrjeđenja kvantitativne kontrole omogućavaju generiranje kalibracijskih krivulja i koriste se za procjenu sadržaja kliničkih genokopija u kliničkim uzorcima.
U definiciji kvantitativnog PCR-a, ključno dostignuće je stvaranjefluorescentne DNK sonde koje se dodaju u reakcionu smjesu istovremeno sa jednostavnim prajmerima i omogućavaju vam da na vrijeme pratite PCR proces, odnosno PCR u realnom vremenu.
TaqMan metodologija se odnosi na sintezu fluorescentnih DNK sondi koje su specifične za srednji dio amplikona i imaju dvije oznake na krajevima. Jedna od njih je fluorescentna etiketa, druga je molekul za gašenje ove fluorescencije.
Poseban uređaj, koji je hibrid fluorimetra i termoblok-pojačala, vrši konstantna mjerenja fluorescencije u svakoj epruveti (PCR princip u realnom vremenu). Nakon 20-40 ciklusa PCR, pojedinačne krive će se dobiti za svaki uzorak. Broj kopija željenog gena koji se nalazi u uzorku za testiranje može se izračunati iz kalibracijskih krivulja sa kontrolnim uzorcima.
Takođe, važna karakteristika implementacije PCR-a fluorescentnom metodom je da nema potrebe za otvaranjem epruveta sa PCR mješavinom kada se uzimaju u obzir rezultati. Ovo smanjuje mogućnost kontaminacije prostorije proizvodima za pojačavanje, a nema potrebe za izdvajanjem posebnih radnih površina za elektroforezu.
Šta pokazuje kvantitativni PCR transkript?
Šta se otkriva?
Metodom kao što je kvantitativni PCR, pronalaze se kvalitativne promjene u genima: insercije, delecije i tačkaste mutacije. Ali kod nekih nasljednih poremećaja, odgovarajući simptomi se javljaju kao odgovor na promjenu sadržaja određenih gena.
HvalaKvantitativna analiza daje numerički rezultat, najčešće u IU/ml. To znači da je u jednom mililitru testnog uzorka pronađen određeni broj kopija RNK ili DNK patogena, mjereno u međunarodnim jedinicama.
U zavisnosti od magnitude, dijagnostikuje se ozbiljnost infekcije. Krv se obično testira da bi se odredilo virusno opterećenje, jer se virusi slobodno kreću u krvi tokom bolesti.
Karakteristike
Kvantitativni PCR u testu krvi ima dvije karakteristike.
- Analiza se izvodi u prisustvu prajmera ili deoksiribonukleozid trifosfata, koji su označeni fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom kako bi se precizno odredio sadržaj formiranog PCR proizvoda.
- U PCR procesu, završite reakciju ranije prije nego što se pojavi previše PCR proizvoda. To je zbog činjenice da u završnoj fazi zasićenja, kada ima puno PCR proizvoda, i sam enzim i supstrati djeluju kao ograničavajuće karike ove reakcije. Završetak sljedećeg PCR ciklusa pod ovakvim uvjetima više nije karakteriziran udvostručenjem broja PCR proizvoda, niveliraju se neznatne kvantitativne razlike između različitih uzoraka, koje su prilično jasno definirane u ranim fazama nakon prolaska kroz niz reakcionih ciklusa..
Cijena PCR dijagnostike
PCR istraživanje ima cijenu, koja ovisi o vrsti infekcije koja će se testirati, o metodologiji analize i testnom materijalu. Da biste utvrdili jednu infekciju, moraćete da se predate200-800 rubalja. Dodata je i naknada za uzimanje biomaterijala - otprilike 400 rubalja.
