Za utvrđivanje kvalitativnog sastava mnogih prehrambenih proizvoda koristi se ksantoproteinska reakcija za proteine. Prisustvo aromatičnih aminokiselina u jedinjenju će dati pozitivnu promjenu boje testnog uzorka.
Šta je protein
Zove se i protein, koji je građevinski materijal za živi organizam. Proteini održavaju volumen mišića, obnavljaju oštećene i mrtve strukture tkiva različitih organa, bilo da se radi o kosi, koži ili ligamentima. Uz njihovo učešće nastaju crvena krvna zrnca, reguliše se normalno funkcionisanje mnogih hormona i ćelija imunog sistema.
Ovo je složen molekul, koji je polipeptid sa masom većom od 6103 d altona. Strukturu proteina formiraju ostaci aminokiselina u velikim količinama, povezani peptidnom vezom.
Proteinska struktura
Odlika ovih supstanci u poređenju sa peptidima male molekularne težine je njihova razvijena prostorna trodimenzionalna struktura, podržana uticajima različitihstepen privlačnosti. Proteini imaju strukturu na četiri nivoa. Svaki od njih ima svoje karakteristike.
Primarna organizacija njihovih molekula zasniva se na sekvenci aminokiselina, čija se struktura prepoznaje reakcijom ksantoproteina na protein. Takva struktura je periodično ponavljajuća peptidna veza -HN-CH-CO-, a radikali bočnog lanca u aminokarboksilnim kiselinama su selektivni dio. Oni su ti koji određuju svojstva supstance kao celine u budućnosti.
Primarna struktura proteina se smatra dovoljno snažnom, to je zbog prisustva jakih kovalentnih interakcija u peptidnim vezama. Formiranje narednih nivoa se dešava u zavisnosti od znakova ustanovljenih u početnoj fazi.
Formiranje sekundarne strukture moguće je zbog uvrtanja sekvence aminokiselina u spiralu, u kojoj se između zavoja uspostavljaju vodonične veze.
Tercijarni nivo organizacije molekula nastaje kada se jedan dio spirale preklopi na druge fragmente uz nastanak svih vrsta veza između njih, sa vodikom, disulfidom, kovalentnim ili jonskim spojem. Rezultat su asocijacije u obliku globula.
Prostorni raspored tercijarnih struktura sa formiranjem hemijskih veza između njih dovodi do formiranja konačnog oblika molekule ili kvaternarnog nivoa.
Aminokiseline
Oni određuju hemijska svojstva proteina. Postoji oko 20 glavnih aminokiselina,uključeni u sastav polipeptida u različitim sekvencama. Ovo također uključuje rijetke aminokarboksilne kiseline u obliku hidroksiprolina i hidroksilizina, koji su derivati bazičnih peptida.
Kao znak ksantoproteinske reakcije prepoznavanja proteina, prisustvo pojedinačnih aminokiselina daje promjenu boje reagensa, što ukazuje na prisustvo specifičnih struktura u njihovom sastavu.
Kako se ispostavilo, sve su to karboksilne kiseline, u kojima je atom vodonika zamijenjen amino grupom.
Primer strukture molekula je strukturna formula glicina (HNH− HCH− COOH) kao najjednostavnije amino kiseline.
U ovom slučaju, jedan od vodonika CH2- ugljik može biti zamijenjen dužim radikalom, uključujući benzenski prsten, amino, sulfo, karboksi grupe.
Šta znači reakcija ksantoproteina
Različite metode se koriste za kvalitativnu analizu proteina. Ovo uključuje reakcije:
- biuret sa ljubičastom bojom;
- ninhidrin za formiranje plavo-ljubičaste otopine;
- formaldehid sa crvenim mrljama;
- Folija sa sivo-crnim taloženjem.
Provođenjem svake metode dokazuje se prisustvo proteina i prisustvo određene funkcionalne grupe u njihovoj molekuli.
Postoji reakcija ksantoproteina na protein. Naziva se i Mulderov test. Odnosi se na reakcije boje na proteinima, ukoje su aromatične i heterociklične aminokiseline.
Osoba takvog testa je proces nitriranja cikličkih aminokiselinskih ostataka azotnom kiselinom, posebno dodavanje nitro grupe u benzenski prsten.
Rezultat ovog procesa je formiranje nitro spoja, koji se taloži. Ovo je glavni znak ksantoproteinske reakcije.
Koje se aminokiseline određuju
Ne mogu se otkriti sve aminokarboksilne kiseline ovim testom. Glavna karakteristika ksantoproteinske reakcije prepoznavanja proteina je prisustvo benzenskog prstena ili heterocikla u molekulu aminokiseline.
Iz proteinskih aminokarboksilnih kiselina izdvojene su dvije aromatične kiseline u kojima se nalazi fenil grupa (u fenilalaninu) i hidroksifenil radikal (u tirozinu).
Ksantoproteinska reakcija se koristi za određivanje heterociklične aminokiseline triptofana, koja ima aromatično jezgro indola. Prisustvo gornjih jedinjenja u proteinu daje karakterističnu promjenu boje testnog medija.
Koji se reagensi koriste
Da biste izvršili ksantoproteinsku reakciju, moraćete da pripremite 1% rastvor proteina iz jaja ili povrća.
Uobičajeno koristite kokošje jaje, koje se razbije da bi se dodatno odvojio protein od žumanca. Da bi se dobio rastvor, 1% proteina se razblaži u desetostrukoj količini prečišćene vode. Nakon otapanja proteina, dobivena tekućina mora se filtrirati kroz nekoliko slojeva gaze. Ovu otopinu treba čuvati na hladnom mjestu.
Reakciju možete izvesti s biljnim proteinima. Za pripremu otopine koristi se pšenično brašno u količini od 0,04 kg. Dodati 0,16 l prečišćene vode. Sastojci se miješaju u tikvici, koja se stavlja na 24 sata na hladno mjesto na temperaturi od oko +1°C. Nakon jednog dana otopina se promućka, nakon čega se prvo filtrira vatom, a zatim papirnim naboranim filterom. Dobivena tečnost se čuva na hladnom mestu. U takvom rješenju postoji uglavnom frakcija albumina.
Za izvođenje ksantoproteinske reakcije, koncentrovana dušična kiselina se koristi kao glavni reagens. Dodatni reagensi su rastvor 10% natrijum hidroksida ili amonijaka, rastvor želatine i nekoncentrovani fenol.
Metodologija
U čistu epruvetu dodajte 1% rastvor proteina jaja ili brašna u količini od 2 ml. U njega se dodaje oko 9 kapi koncentrovane azotne kiseline kako bi se spriječilo ispadanje pahuljica. Dobijena smjesa se zagrijava, kao rezultat, talog postaje žut i postepeno nestaje, a njegova boja prelazi u otopinu.
Kada se tečnost ohladi, oko 9 kapi koncentrovanog natrijum hidroksida se dodaje u epruvetu duž zida, što je višak za proces. Reakcija medija postaje alkalna. Sadržaj u tubi postaje narandžasti.
Karakteristike
Budući da se ksantoprotein naziva kvalitativnom reakcijom na proteine poddjelovanjem dušične kiseline, tada se ispitivanje provodi ispod priložene nape. Pridržavajte se svih sigurnosnih mjera pri radu sa koncentrovanim kaustičnim supstancama.
Tokom procesa zagrijavanja, sadržaj cijevi može biti izbačen, što treba uzeti u obzir prilikom fiksiranja u držač i odabira nagiba.
Uzimanje koncentrovane azotne kiseline i natrijum hidroksida treba vršiti isključivo staklenom pipetom i gumenom kruškom, zabranjeno je kucati na usta.
Uporedna reakcija sa fenolom
Da bi se ilustrovao proces i potvrdilo prisustvo fenil grupe, sličan test je izveden sa hidroksibenzenom.
U epruvetu uneti 2 ml razblaženog fenola, a zatim postepeno, duž zida, dodati 2 ml koncentrovane azotne kiseline. Otopina se podvrgava zagrijavanju, zbog čega postaje žuta. Ova reakcija je kvalitativna za prisustvo benzenskog prstena.
Proces nitriranja hidroksibenzena sa azotnom kiselinom je praćen stvaranjem smeše paranitrofenola i ortonitrofenola u procentualnom odnosu 15 do 35.
Poređenje želatina
Da bi se dokazalo da reakcija ksantoproteina na protein otkriva samo aminokiseline sa aromatičnom strukturom, koriste se proteini koji nemaju fenolnu grupu.
U čistu epruvetu unesite 1% rastvor želatine u količini od 2 ml. Dodaje se oko 9 kapi koncentrirane dušične kiseline. Dobivena smjesa se zagrijava. Otopina ne žuti, što dokazuje odsustvoaminokiseline sa aromatičnom strukturom. Ponekad se primećuje blago žutilo podloge zbog prisustva proteinskih nečistoća.
Hemijske jednadžbe
Reakcija ksantoproteina na proteine odvija se u dvije faze. Formula prve faze opisuje proces nitriranja molekula aminokiseline pomoću koncentrirane dušične kiseline.
Primjer je dodavanje nitro grupe tirozinu da nastane nitrotirozin i dinitrotirozin. U prvom slučaju, jedan NO2-radikal je vezan za benzenski prsten, au drugom slučaju dva atoma vodika su zamijenjena sa NO2. Hemijska formula ksantoproteinske reakcije predstavljena je interakcijom tirozina sa azotnom kiselinom kako bi se formirala molekula nitrotirozina.
Proces nitriranja je praćen prelaskom bezbojne boje u žuti ton. Prilikom izvođenja slične reakcije s proteinima koji sadrže aminokiselinske ostatke triptofana ili fenilalanina, boja otopine se također mijenja.
U drugoj fazi, produkti nitriranja molekula tirozina, posebno nitrotirozina, stupaju u interakciju sa amonijum ili natrijum hidroksidom. Rezultat je natrijeva ili amonijumova so, koja je žuto-narandžaste boje. Ova reakcija je povezana sa sposobnošću molekula nitrotirozina da pređe u hinoidni oblik. Kasnije se iz nje formira sol azotne kiseline, koja ima kinonski sistem dvostruko konjugiranih veza.
Ovako se završava reakcija ksantoproteina na proteine. Jednačina dvafaza je prikazana iznad.
Rezultati
Tokom analize tečnosti sadržanih u tri epruvete, kao referentna otopina služi razrijeđeni fenol. Supstance s benzenskim prstenom daju kvalitativnu reakciju s dušičnom kiselinom. Kao rezultat, mijenja se boja otopine.
Kao što znate, želatina uključuje kolagen u hidrolizovanom obliku. Ovaj protein ne sadrži aromatične aminokarboksilne kiseline. Prilikom interakcije sa kiselinom, nema promjene u boji medija.
U trećoj epruveti uočena je pozitivna reakcija ksantoproteina na proteine. Zaključak se može izvesti na sljedeći način: svi proteini s aromatičnom strukturom, bilo da se radi o fenilnoj grupi ili indolnom prstenu, daju promjenu boje otopini. To je zbog stvaranja žutih nitro spojeva.
Provođenje reakcije u boji dokazuje prisustvo raznih hemijskih struktura u aminokiselinama i proteinima. Primjer želatine pokazuje da sadrži aminokarboksilne kiseline koje nemaju fenilnu grupu ili cikličku strukturu.
Reakcija ksantoproteina može objasniti žutilo kože kada se na nju nanese jaka dušična kiselina. Mliječna pjena će dobiti istu boju kada se s njom izvrši takva analiza.
U medicinskoj laboratorijskoj praksi, ovaj uzorak boje se ne koristi za otkrivanje proteina u urinu. To je zbog žute boje samog urina.
Ksantoproteinska reakcija se sve više koristi za kvantifikaciju aminokiselina kao što su triptofan i tirozin u različitim proteinima.
