Rekombinantna DNK su molekuli formirani laboratorijskim tehnikama genetske rekombinacije za kombinovanje genetskog materijala iz više izvora. Moguće je zato što molekuli DNK svih organizama imaju istu hemijsku strukturu i razlikuju se samo po nukleotidnoj sekvenci unutar njih.
Kreacija
Molekularno kloniranje je laboratorijski proces koji se koristi za stvaranje rekombinantne DNK. To je jedna od dvije najčešće korištene metode, zajedno sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR). Omogućava vam da kontrolišete replikaciju bilo koje određene sekvence DNK koju odabere eksperimentator.
Postoje dvije fundamentalne razlike između metoda rekombinantne DNK. Jedan je da molekularno kloniranje uključuje replikaciju u živoj ćeliji, dok PCR uključuje in vitro. Druga razlika je u tome što prva metoda omogućava rezanje i lijepljenje sekvenci DNK, dok je druga poboljšana kopiranjem postojećeg reda.
Vektorska DNK
Za dobijanje rekombinantne DNK potreban je vektor za kloniranje. Izvodi se iz plazmida ili virusa i relativno je mali segment. Izbor vektora za molekularno kloniranje zavisi od izbora organizma domaćina, veličine DNK koja se klonira i da li će strani molekuli biti eksprimirani. Segmenti se mogu kombinovati korištenjem različitih metoda kao što je kloniranje restrikcijskim enzimom/ligazom ili Gibsonov sklop.
Kloniranje
U standardnim protokolima, kloniranje uključuje sedam koraka.
- Odaberi organizam domaćina i vektor za kloniranje.
- Dobivanje DNK vektora.
- Formiranje klonirane DNK.
- Kreiranje rekombinantne DNK.
- Uvođenje u organizam domaćina.
- Izbor organizama koji ga sadrže.
- Odabir klonova sa željenim DNK umetcima i biološkim svojstvima.
Nakon transplantacije u organizam domaćina, strani molekuli sadržani u rekombinantnom konstruktu mogu, ali ne moraju biti eksprimirani. Ekspresija zahtijeva restrukturiranje gena kako bi se uključile sekvence koje su neophodne za proizvodnju DNK. Koristi ga prevodilačka mašina domaćina.
Kako radi
Rekombinantna DNK radi kada ćelija domaćina eksprimira protein iz rekombinantnih gena. Ekspresija zavisi od okruženja gena skupom signala koji daju uputstva za njegovu transkripciju. Oni uključuju promoter, vezivanje ribosoma i terminator.
Problemi nastaju ako gensadrži introne ili signale koji djeluju kao terminatori za bakterijskog domaćina. To dovodi do prijevremenog prekida. Rekombinantni protein može biti nepropisno obrađen, savijen ili degradiran. Njegova proizvodnja u eukariotskim sistemima obično se javlja u kvascima i filamentoznim gljivama. Upotreba kaveza za životinje je teška zbog potrebe za jakom potpornom površinom za mnoge.
Svojstva organizama
Organizmi koji sadrže rekombinantne DNK molekule imaju naizgled normalne fenotipove. Njihov izgled, ponašanje i metabolizam obično se ne mijenjaju. Jedini način da se demonstrira prisustvo rekombinantnih sekvenci je ispitivanje same DNK pomoću testa lančane reakcije polimeraze.
U nekim slučajevima, rekombinantna DNK može imati štetne efekte. Ovo se može dogoditi kada se njegov fragment koji sadrži aktivni promotor nalazi pored prethodno tihog gena ćelije domaćina.
Koristite
Rekombinantna DNK tehnologija se široko koristi u biotehnologiji, medicini i istraživanju. Njegovi proteini i drugi proizvodi mogu se naći u gotovo svakoj zapadnoj ljekarni, veterinarskoj klinici, ordinaciji, medicinskoj ili biološkoj laboratoriji.
Najčešća primjena je u osnovnim istraživanjima, gdje je tehnologija neophodna za veći dio današnjeg rada u biološkim i biomedicinskim naukama. Rekombinantna DNK se koristi za identifikaciju, mapiranje i sekvenciranje gena i njihovo određivanjefunkcije. rDNK sonde se koriste za analizu ekspresije gena u pojedinačnim ćelijama iu tkivima čitavih organizama. Rekombinantni proteini se koriste kao reagensi u laboratorijskim eksperimentima. Neki konkretni primjeri su dati ispod.
Rekombinantni kimozin
Pronađen u sibuhu, kimozin je enzim potreban za proizvodnju sira. Bio je to prvi genetski modificirani aditiv za hranu korišten u industriji. Mikrobiološki proizveden rekombinantni enzim strukturno identičan enzimu dobivenom od teleta je jeftiniji i proizvodi se u većim količinama.
Rekombinantni humani insulin
Virtualno zamijenjen inzulin dobiven iz životinjskih izvora (npr. svinje i goveda) za liječenje dijabetesa ovisnog o inzulinu. Rekombinantni inzulin se sintetizira uvođenjem gena za humani inzulin u bakterije iz roda Eterichia ili kvasca.
Hormon rasta
Propisuje se pacijentima čija hipofiza ne proizvodi dovoljno hormona rasta za normalan razvoj. Prije nego što je rekombinantni hormon rasta postao dostupan, dobivao se iz hipofize leševa. Ova nesigurna praksa dovela je do toga da neki pacijenti razviju Creutzfeldt-Jakobovu bolest.
Rekombinantni faktor koagulacije
Ovo je protein za zgrušavanje krvi koji se daje pacijentima sa oblicima hemofilije sa poremećajima krvarenja. Oni nisu u stanju da proizvodefaktor VIII u dovoljnim količinama. Prije razvoja rekombinantnog faktora VIII, protein je napravljen obradom velikih količina ljudske krvi od više donatora. Ovo je nosilo veoma visok rizik od prenošenja zaraznih bolesti.
Dijagnoza HIV infekcije
Svaka od tri široko korištene metode za dijagnosticiranje HIV infekcije razvijena je korištenjem rekombinantne DNK. Test na antitela koristi njen protein. On detektuje prisustvo HIV genetskog materijala koristeći lančanu reakciju polimeraze reverzne transkripcije. Razvoj testa je omogućen molekularnim kloniranjem i sekvenciranjem HIV genoma.
